感受态细胞制备方法
感受态细胞是基因工程中用于吸收外源DNA的细菌细胞，常用制备方法包括化学转化法和电转化法。以下是两种方法的详细步骤及关键要点：
一、化学转化法（CaCl₂法）
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菌体培养
- 挑取单菌落接种至3-5 mL LB培养基，37℃振荡培养过夜24；
- 按1:100比例转接至新鲜LB培养基，37℃剧烈振荡培养至OD₆₀₀=0.3-0.5（对数生长期）。
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低温处理与离心
- 菌液冰浴10-15分钟终止生长，随后4℃离心（3000-4000 g，5-10分钟）收集菌体；
- 弃上清，用预冷的0.05-0.1 M CaCl₂溶液轻柔悬浮菌体，冰浴20-30分钟。
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分装与保存
- 再次离心后弃上清，加入含15%甘油的CaCl₂溶液重悬，分装至无菌EP管（每管100-200 μL）；
- 液氮速冻后于-70℃/-80℃保存，有效期可达6个月。
关键点：
- 细菌需处于对数生长期以提高转化效率；
- 全程低温操作以维持细胞膜通透性；
- Ca²⁺通过改变细胞膜电荷促进DNA吸附。
二、电转化法
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菌体预处理
- 菌液培养至OD₆₀₀≈0.5，冰浴后离心收集菌体；
- 用预冷的10%甘油溶液反复洗涤菌体2-3次，去除残留培养基。
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电击前准备
- 菌体重悬于少量10%甘油中，分装成40-50 μL小份；
- 加入外源DNA后立即进行电击（电场强度通常为1.8-2.5 kV/cm）。
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复苏与保存
- 电击后迅速加入复苏培养基（如SOC），37℃振荡培养1小时；
- 分装后-80℃保存，适用于长期使用。
优势：
- 转化效率高于化学法，适用于大质粒或基因组DNA；
- 无需热激步骤，减少细胞损伤。
注意事项
- 菌株选择：常用大肠杆菌DH5α、BL21等易转化菌株；
- 无菌操作：所有试剂及耗材需高压灭菌，避免污染；
- 质量控制：通过转化空载体或已知质粒验证感受态效率。
不同方法对比
| 方法 | 转化效率 | 操作复杂度 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| 化学转化法 | 中等（10⁶-10⁷） | 简单 | 常规质粒转化 |
| 电转化法 | 高（10⁸-10⁹） | 复杂 | 大片段DNA或文库构建 |
通过上述方法制备的感受态细胞可满足多数基因克隆需求，具体选择需结合实验目的及设备条件。